Hibridização Genômica Comparativa (CGH)

A hibridização genômica comparativa é uma abordagem da citogenética molecular que fornece uma visão geral do genoma e, permite, assim, a detecção de alterações no número de cópias do DNA em um único experimento, sem a necessidade de conhecimento prévio de regiões genômicas de interesse (MALMGREN et al., 2002; TONNIES et al., 2005; OBRADORS et al., 2008; VEIGA-CASTELLI et al., 2010). Além da detecção de aneuploidias, o CGH é capaz de detectar anomalias estruturais que resultam em perdas e ganhos de material cromossômico (FRAGOULI et al., 2008). Este método proporciona uma maior incidência de constituições cromossômicas anormais devido ao fato de apresentar uma maior resolução na percepção de anormalidades (DANIELY et al., 1998). É baseado em amostras de DNA, sendo assim, aplicável às células em qualquer fase do ciclo celular (WELLS et al., 2008; MENTEN et al., 2009). Muitas das limitações da análise de banda G, incluindo culturas celulares falhadas e morfologia cromossômica pobre, são contornadas pelo uso do DNA genômico. Desta forma, o CGH supera as técnicas da citogenética convencional, tornando-se uma importante ferramenta na citogenética clínica (DANIELY et al., 1998). 

O método de hibridização genômica comparativa foi desenvolvido com o objetivo de avaliar as perdas e ganhos cromossômicos em um pequeno número de células obtidas de tumores sólidos (KALLIONEMI et al., 1992). Desde então, a técnica tem sido aplicada principalmente no campo da genética do câncer, e em laboratórios de citogenética clínica (BRYNDORF et al., 1995) para detectar e caracterizar aneuploidias totais e segmentares em diferentes tipos de tecidos (FRITZ et al., 2000). Estudos recentes tem mostrado que a análise de CGH, de DNA extraído de um tecido fetal cultivado e embebido na parafina fornece uma alternativa eficiente para a detecção de anomalias cromossômicas fetais (DANIELY et al., 1998; BELL et al., 2001; FRITZ et al., 2001; TABET et al., 2011).

Para a realização da técnica, uma amostra de DNA que irá ser testada e uma amostra de DNA referência, com genótipo normal, são marcadas com fluorocromos de cores diferentes, normalmente verde e vermelho, respectivamente. Essas amostras são unidas e hibridizadas com cromossomos metafásicos humanos normais do sexo masculino, presentes em uma lâmina. A hibridização é realizada durante dois a três dias (WILTON, 2005). Em seguida, com o auxílio de um software e de um sistema de imagem computadorizada, é possível analisar as fluorescências ao longo do comprimento dos cromossomos metafásicos (CATELANI, 2010). Através da comparação de intensidade dos dois DNAs nas diferentes regiões cromossômicas, pode-se detectar alterações no DNA teste (CARREL, 2008; CATELANI, 2010). Por exemplo, se o DNA teste é normal em certo cromossomo, haverá uma quantidade igual de fluorescência das duas cores utilizadas. Mas, se houver alguma perda de material no DNA teste a fluorescência utilizada para este aparecerá em menor quantidade, comparada com a fluorescência usada no DNA referência. E se houver um ganho de material no DNA teste, a fluorescência utilizada para este aparecerá em maior quantidade (WILTON, 2005). Esta razão de fluorescência pode ser determinada para cada cromossomo, permitindo a formação de um cariótipo molecular completo (WILTON, 2005).

Apesar dos estudos promissores, o CGH apresenta algumas limitações na avaliação de alterações genéticas e cromossômicas: não detecta rearranjos equilibrados (DANIELY et al., 1998; CATELANI, 2010) e nem poliploidias (GUTIERREZ-MATEO et al., 2004; MENTEN et al., 2009). Como o CGH requer técnicas altamente especializadas, tais como a extração do DNA, a rotulagem com fluorocromos junto com as traduções nick e, a hibridização, sua criação para o uso clínico exige tempo e esforço. Um laboratório de citogenética médio exige cerca de seis meses para estabelecer a técnica (FRITZ et al., 2001). Seu custo e o fato de ser uma técnica trabalhosa também são fatores que o limitam para o uso rotineiro (KIRCHHOF et al., 2000; MENTEN et al., 2009).

Ideograma mostrando ganhos e perdas genômicas em todos os cromossomos.

aCGH no cromossomo 3 normal.

Utilização do CGH no diagnóstico genético pré-implantacional (PGD)

Os profissionais de reprodução assistida são constantemente confrontados com a obtenção de gravidezes viáveis (SHER et al., 2009). A fim de maximizar a probabilidade de resultar em uma gravidez, a maioria dos ciclos de fertilização in vitro envolve a transferência de mais de um embrião. Embora a abordagem aumente as chances de obtenção de uma gravidez, também leva a um elevado risco de gestações múltiplas (WELLS et al., 2008). A transferência de um embrião único é eficaz na redução de gestações múltiplas, ao mesmo tempo em que aumenta a probabilidade de que nenhum embrião viável seja transferido, o que pode diminuir as taxas de gravidez (SCHOOLCRAF et al., 2009).

A fim de manter as taxas de gestação satisfatórias e reduzir o número de embriões transferidos, é essencial identificar os embriões com maior potencial para a formação de uma gravidez e garantir que esses embriões sejam uma prioridade na transferência (WELLS et al., 2008). Atualmente, a decisão de quais embriões serão utilizados é feita com base na sua capacidade de crescer até o estágio de blastocisto (MENEZO et al., 1992) e nos critérios morfológicos (PLACHOT et al., 1990). Infelizmente, esses exames não fornecem informações sobre o número de cópias cromossômicas, que é um dos aspectos mais importantes na viabilidade embrionária (SCHOOLCRAF et al., 2009). Sabe-se que cerca de 37% dos embriões trissômicos atingem o estágio de blastocisto e 70% dos embriões morfologicamente normais são aneuplóides (IWARSSON et al., 1999; SANDALINAS et al., 2001). 

A maioria dos erros cromossômicos é incompatível com a implantação ou o nascimento e, portanto previstos para afetar negativamente os tratamentos de reprodução assistida (FRAGOULI et al., 2009). Como resultado, os especialistas em reprodução têm frequentemente utilizado o diagnóstico genético pré-implantacional na tentativa de selecionar os embriões mais propensos a ter um cariótipo normal (VOULLAIRE et al., 2002) e, consequentemente aumentar a probabilidade de implantação e de desenvolvimento em uma criança saudável (DELHANTY et al., 1993; MUNNE et al., 1993; COLLS et al., 2007). Com os avanços da tecnologia molecular, como o CGH e a utilização de microarrays de DNA, o alcance do PGD tem sido aumentado (SHER et al., 2007; HELLANI et al., 2008; HANDSYDE et al., 2009; VANNESTE et al., 2009; WELLS et al., 2008).

A hibridização genômica comparativa é uma técnica ideal para o diagnóstico genético pré-implantacional (LANDWEHR et al., 2008), pois realiza o cariótipo completo de todos os 46 cromossomos, fornecendo uma ferramenta poderosa para uma análise confiável de aneuploidias em oócitos e embriões e, permitindo a transferência de embriões “competentes” (SHER et al., 2009). A primeira aplicação com sucesso do CGH no PGD foi para uma mulher de 38 anos de idade, que sofreu falhas de implantação, inclusive de embriões diagnosticados como normais por cinco cromossomos usados na análise de Hibridização Fluorescente in situ (FISH) (WILTON, 2005). A análise CGH em blastômeros biopsiados encontrou um em cinco embriões como normal para todos os cromossomos. Este embrião foi transferido e resultou no nascimento de um bebê saudável (WILTON et al., 2001). Estudos publicados que utilizaram CGH revelam que de 20 a 40% dos embriões carregam anormalidades cromossômicas que não seriam detectados pelo FISH comercialmente disponível (WELLS E DELHANTY, 2000; VOULLAIRE et al., 2002; WILTON et al., 2003). A técnica de CGH tem fornecido dados úteis referentes à aneuploidias e mosaicismo em oócitos e embriões humanos, porém sua aplicação foi prejudicada devido a longa duração dos protocolos normais, que exigem um tempo de análise de 3 ou mais dias (WELLS et al., 2002; LANDWEHR et al., 2008). No entanto, através da criopreservação dos embriões ou oócitos biopsiados torna-se possível a obtenção de resultados e a transferência dos embriões selecionados em outro ciclo. Outra possibilidade é a realização da transferência no estágio de blastocisto, no caso da biópsiaem oócito (MALMGREN et al., 2002).

Portanto, a hibridização genômica comparativa utilizando microarrays tem sido aplicada com sucesso no PGD para a detecção de aneuploidias.  Esta abordagem tem permitido que a análise dos cromossomos seja realizada em menos de 30 horas, dentro do prazo necessário para que os oócito e embriões, inclusive blastocistos, classificados como normais sejam transferidos, sem haver a necessidade de criopreservação (WELLS et al., 2008).

CGH para análise de corpúsculos polares

Uma forma de contornar a necessidade de criopreservação de embriões e, ainda permitir o cariótipo completo utilizando a técnica de CGH convencional é analisar os corpúsculos polares (WELLS et al., 2002). A análise do corpúsculo polar (CP) permite a caracterização citogenética indireta do oócito correspondente (OBRADORS et al., 2008), ou seja, ganhos e perdas cromossômicas do corpúsculo polar são acompanhados de perdas e ganhos recíprocos no oócito (WELLS et al., 2002). A biópsia do CP é feita no dia da fertilização e, os resultados do CGH podem ser obtidos no dia 3 ou 4, o que permite a transferência de embriões derivados de oócitos geneticamente normais no mesmo ciclo (WELLS et al., 2002). Um estudo realizado com o primeiro e o segundo corpúsculo polar utilizando a análise FISH indicou que a resolução de erros da meiose ocorre com uma frequência semelhante em ambas às divisões meióticas, com 42% dos oócitos anormais tendo o primeiro CP anormal, 31% com o segundo CP anormal e, 27% com os dois CP anormais (KULIEV et al., 2003). Este resultado deve-se as altas taxas de pré-divisão das cromátides durante a primeira meiose, o que pode levar à geração de um desequilíbrio cromossômico após a meiose I ou II (ANGELL, 1991).

A análise citogenética completa dos oócitos é uma abordagem considerável a fim de aumentar as taxas de gravidez, mesmo em casos de mulheres jovens, que também apresentam uma taxa de aneuploidia sensível em seus oócitos, embora significativamente menor que a taxa das pacientes mais velhas (SHER et al., 2007). Esta abordagem permite a detecção de aneuploidias decorrentes das divisões meióticas do oócito, que são responsáveis pela maioria dos desequilíbrios cromossômicos (WELLS et al., 2002). A triagem de aneuploidias por CGH em corpúsculos polares tem sido aplicada com sucesso para o diagnóstico genético pé-implantacional (WELLS et al., 2002). Sua primeira aplicação clínica foi realizada em uma paciente com idade materna avançada (WILTON et al., 2003).

Apesar do CGH em corpúsculos polares evitar a necessidade de criopreservação de embriões e detectar a maioria das anomalias cromossômicas, originárias das divisões meióticas, a técnica é limitada, pois os erros meióticos paternos e os erros pós-zigóticos (mitóticos), como o mosaicismo (HARPER et al., 1995; DELHANTY et al., 1997; MUNNE et al., 2002) não são detectados (RIUS et al., 2010).

CGH em blastocistos

A biópsia de células do trofoectoderma de blastocistos é uma proposta cada vez mais atraente e prevalente do que as biópsias de corpúsculos polares e de blastômeros, pois permite a detecção de aneuploidias originárias da mitose e da meiose e, só é realizada em blastocistos que apresentam boa qualidade e que tiveram a oportunidade de se “auto-corrigir” (JOHNSON et al., 2010). A biópsia do blastocisto utilizando métodos de micromanipulação foi primeiramente relatada por Dorkas et al. (1990), embora não foi realizada no contexto da sua aplicação clínica (DORKAS et al., 1990). O desenvolvimento de lasers facilitou este tipo de biópsia, pois forma um pequeno orifício na zona pelúcida, o qual, após um período em cultura, é responsável pela saída de algumas células do trofoectoderma (VEIGA et al., 1997). Desta forma, não há a necessidade de maiores métodos de micromanipulação para a retirada das células do embrião.

Com a utilização do método de CGH para a biópsia das células trofoectodérmicas do blastocisto, há a necessidade de criopreservação dos embriões biopsiados e sua transferência em um ciclo subsequente (FRAGOULI et al., 2008). Estudos recentes envolvendo a criopreservação de blastocistos biopsiados têm fornecido resultados encorajadores (BOER et al., 2004; MCARTHUR et al., 2005; KOKKALI et al., 2007). A criopreservação de blastocistos após a biópsia e sua transferência em um próximo ciclo podem também permitir uma melhor sincronização entre o embrião e o útero, o que parece melhoarar as taxas de implantação e gravidez (FRAGOULI et al., 2008). Além disso, com os avanços na tecnologia dos microarrays, o CGH-array pode ser executado em menos de 30 horas (HU et al., 2004), fornecendo tempo suficiente para a análise citogenética do embriões e, a transferência dos blastocistos biopsiados no dia 6. 

A transferência de blastocistos no contexto dos tratamentos de fertilização in vitro está associada com maiores taxas de implantação em comparação com a transferência de embriões em estágios precoces de desenvolvimento (FRAGOULI et al., 2008). A capacidade dos blastocistos de implantar após a biópsia do trofoectoderma foi relatada em estudos com animais (GARDNER E EDWARDS, 1968; GARDNER, 1971; BETTERIDGE et al., 1981; MONK et al., 1988; SUMMERS et al., 1988) e, mais recentemente, gestações após a biópsia de blastocistos humanos têm sido divulgadas (BOER et al., 2004; TONGYAI et al., 2004; KOKKALI et al., 2005; MCARTHUR et al., 2005). As taxas semelhantes de implantação e de gravidez obtidas por estes estudos não foram estatisticamente diferentes, o que sugere que o potencial de implantação dos blastocistos após a biópsia não é comprometido (KOKKALI et al., 2007).

A biópsia de células do trofoectoderma fornece uma seleção baseada em critérios mais objetivos, já que os embriões devem demonstrar um potencial de desenvolvimento contínuo até o estágio de blastocisto para serem avaliados. Apesar do desenvolvimento até este estágio não ser uma garantia de normalidade cromossômica, a maioria dos embriões que não consegue continuar em cultura prorrogada apresentam aneuploidias múltiplas nos cromossomos X, Y, 16, 18 e 21 (MAGLI et al., 2000). Chegar e sobreviver até a fase de blastocisto apresenta uma série de desafios potenciais para os embriões, pois o embrião apresenta poucos, se não nenhum, RNA mensageiro transcrito materno, sendo assim, dependente do seu próprio genoma, ativado 2 dias antes (FRAGOULI et al., 2008). Estudos sugerem que os blastocistos humanos, assim como os embriões em estágio de clivagem, apresentam níveis significativos de anomalias cromossômicas. No entanto, a frequência de embriões aneuplóides e, a proporção de células anormais em embriões mosaicos parece ser reduzida nos blastocistos, em comparação com os embriões em fase de clivagem (EVSIKOV E VERLINSKY, 1998; COONEN et al., 2004).

As análises de PGD com base em corpúsculos polares ou blastômeros apresentam como desvantagem uma limitada quantidade de material disponível para a triagem citogenética. Um aumento na quantidade de DNA amostral inicial, a princípio, aumenta a sensibilidade e a confiabilidade do diagnóstico genético. Desta forma, a biópsia de múltiplas células do trofoectoderma de blastocistos apresenta uma maior precisão nos resultados de PGD (KOKKALI et al., 2007). As células do trofoectoderma contribuem apenas para os tecidos extra-embrionários, por isso, a remoção destas células para biópsia evita qualquer risco de afetar o desenvolvimento do feto, que é proveniente exclusivamente da massa celular interna (KOKKALI et al., 2007). Além disso, a remoção de 4 a 5 células de um blastocisto com mais de 100 células representa uma menor proporção de perda do que uma célula para um embrião de 6 a 8 células (KOKKALI et al., 2007).

Existem evidências da existência de um mosaicismo entre o trofoectoderma (TE) e a massa celular interna (MCI), chamado de “mosaicismo placental confinado”, no qual a placenta é um mosaico aneuplóide e o feto é euplóide (KALOUSEK E DILL, 1983). Estudos comparando as células do trofoectoderma e da massa celular interna apresentam, na maioria das vezes, concordância na presença de aneuploidas (CLOUSTON et al., 1997; FRAGOULI et al., 2008), o que confirma as observações de Evsikov e Verlinsky (1998), que descobriram que as células aneuplóides e normais são distribuídas uniformemente pelo TE e MCI em blastocistos humanos (EVSIKOV E VERLINSKY, 1998). Isso indica que é possível avaliar com precisão a constituição cromossômica dos blastocistos através da análise das células do trofoectoderma (FRAGOULI et al., 2008).